งานวิจัย ในโครงการ อพสธ.จุฬาฯ

บทคัดย่อ

การศึกษาความหลากหลายทางชีวภาพของซิลิเอตส่วนใหญ่อาศัยข้อมูลทางสัณฐานวิทยาเป็นพื้นฐาน อย่างไรก็ตาม การศึกษาในระดับสัณฐานวิทยาของซิลิเอตบางครั้งอาจทำได้ไม่ง่ายนัก เนื่องจากซิลิเอตเป็นสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็ก และบ่อยครั้งต้องอาศัยเทคนิคอื่นเข้าช่วยในการศึกษา นอกจากนี้ในบางกลุ่มอาจพบมีชนิดซ่อนเร้นที่ไม่แสดงความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาแต่แตกต่างในระดับพันธุกรรม เพื่อให้ได้ข้อมูลความหลากหลายทางชีวภาพที่ถูกต้องครอบคลุมมากที่สุด ปัจจุบันจึงมีการประยุกต์ใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยาที่มีความไวสูง ช่วยในการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพร่วมด้วย การศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความหลากหลายทางชีวภาพ และความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการระดับโมเลกุลของ ซิลิเอตที่อาศัยอยู่ตามช่องว่างระหว่างเม็ดทราย บริเวณหาดลูกลม เกาะแสมสาร จังหวัดชลบุรี โดยใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์ของสมอลซับยูนิตไรโบโซมอลดีเอ็นเอเป็นเครื่องหมายโมเลกุล ทำการเก็บตัวอย่างทรายและคัดแยกโพรติสต์ออกจากตัวอย่างเพื่อสกัดดีเอ็นเอ จากนั้นทำการเพิ่มจำนวนสมอลซับยูนิตไรโบโซมอลดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส โคลนยีนที่เพิ่มจำนวนได้ และหาลำดับนิวคลีโอไทด์จากตัวอย่างที่ศึกษา จากการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้ทั้งหมด 39 สาย พบว่าจำนวน 24 สายมีความใกล้เคียงกับซิลิเอต 8 สกุล ได้แก่ Geleia, Holosticha, Kentrophoros, Orthamphisiella, Paradiscocephalus, Pleuronema, Protogastrostyla และ Trachelocerca และลำดับที่ไม่สามารถระบุสกุลได้จำนวน 3 สาย นอกจากนี้อีก 12 สาย พบมีความใกล้เคียงกับโพรติสต์กลุ่มอื่น การศึกษาความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการระดับโมเลกุลของซิลิเอตที่ได้จากการศึกษาในครั้งนี้กับซิลิเอตชนิดอื่นที่ได้จากฐานข้อมูล GenBank พบลำดับนิวคลีโอไทด์หลายสายจับกลุ่มกันโดยแสดงความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับซิลิเอตทั้งที่สามารถระบุกลุ่มได้และไม่สามารถระบุได้ นอกจากนี้ยังพบลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จับกลุ่มกันเอง โดยไม่แสดงความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับซิลิเอตกลุ่มใด ซึ่งน่าจะชี้ให้เห็นถึงการเป็นกลุ่มทางวิวัฒนาการใหม่ที่ถูกค้นพบในการศึกษาครั้งนี้

คำสำคัญ: ความหลากหลาย, ซิลิเอต, เทคนิคทางชีวโมเลกุล, โพรติสต์, หาดทราย

Abstract

A majority of biodiversity studies of ciliates have been based on information derived from morphological observation. However, due to their nature of having microscopic sizes, examination on the basis of morphological features is not an easy task and often requires some special cytological techniques for thorough study. Moreover, cryptic species whose morphology is indistinguishable but genetically distinct are known in some groups of ciliates. In order to gain accurate and comprehensive data on biodiversity, molecular approaches with high sensitivity are currently employed in combination with other traditional methods. The objectives of this study were to investigate biodiversity and to infer phylogenetic relationships of marine interstitial ciliates of Look-Lom Beach, Samaesarn Island, Chonburi Province using small subunit ribosomal DNA (SSU rDNA) as a molecular marker. Sand samples were collected and protists were then extracted from the samples for subsequent genomic DNA extraction. Polymerase chain reaction, gene cloning, and nucleotide sequencing were conducted to obtain SSU rDNA sequences of the collected samples. A total of 39 SSU rDNA sequences were obtained from this investigation. Of 39 sequences, 24 showed high similarities to ciliate members belonging to eight genera, including Geleia, Holosticha, Kentrophoros, Orthamphisiella, Paradiscocephalus, Pleuronema, Protogastrostyla and Trachelocerca. Three demonstrated close affinities to ciliates of unassigned taxa and the remaining 12 showed their taxonomic identities to various groups of protists. Phylogenetic analysis inferred from SSU rDNA sequences obtained from this study and others retrieved from the GenBank database demonstrated evolutionary relationships of ciliates found in this investigation to both known and unknown ciliate taxa. In addition, some lineages showed no close relationships to any known ciliates and appeared as separate branches, suggesting a presence of novel clades discovered in this study.

Keywords: diversity, ciliate, molecular technique, protist, sand beach

วัตถุประสงค์

เพื่อศึกษาการใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลในการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพของซิลิเอตที่อาศัยอยู่ตามพื้นทรายหน้าดินบริเวณหาดลูกลม เกาะแสมสาร จังหวัดชลบุรี

ภาพที่ 1 ตำแหน่งที่ตั้งของพื้นที่เก็บตัวอย่าง ก. แผนที่ประเทศไทย บริเวณสีทึบแสดงที่ตั้งของจังหวัดชลบุรี และในกรอบสี่เหลี่ยมแสดงตำแหน่งของเกาะแสมสาร (Wikipedia , 2013: online); ข. ภาพถ่ายทางอากาศของเกาะแสมสาร โดยในกรอบแสดงภาพหาดลูกลมซึ่งตั้งอยู่ทางด้านทิศเหนือของเกาะ; และ ค. หมุดแสดงตำแหน่งของหาดลูกลม ในพิกัดละติจูดที่ 12°35'2.04"N และลองจิจูดที่ 100°56'46.92"E [ภาพ ข. และ ค. ที่มา Google Inc., 2013: online ]

ภาพที่ 2 บริเวณพื้นที่เก็บตัวอย่างหาดลูกลม เกาะแสมสาร

ภาพที่ 3 การเก็บตัวอย่างทรายโดยใช้ช้อนพรวนตักทรายที่ยังมีความชื้นหรือน้ำทะเลท่วมถึง

ภาพที่ 4 การสกัดแยกโพรติสต์ออกจากทรายตัวอย่าง โดยตักทรายตัวอย่างใส่ลงในอุปกรณ์สกัด

ภาพที่ 5 การสกัดแยกโพรติสต์ออกจากทรายตัวอย่างด้วยน้ำแข็งตามวิธีของ Uhlig (1964)