งานวิจัย ในโครงการ อพสธ.จุฬาฯ

บทคัดย่อ

การผสมข้ามสายพันธุ์ (hybridization) เป็นการผสมพันธุ์ระหว่างสิ่งมีชีวิตที่มีความใกล้ชิดกันเชิงวิวัฒนาการที่มีโครงสร้างทางพันธุกรรมของประชากรหรือสปีชีส์ที่แตกต่างกัน ทั้งนี้ลูกผสม (hybrids) ที่เกิดขึ้นอาจทำให้เกิดการถ่ายเทเคลื่อนย้ายของยีน (gene flow) ระหว่างประชากรหรือสปีชีส์ได้หากลูกผสมดังกล่าวสามารถอยู่รอดและสืบพันธุ์ได้ ซึ่งสามารถตรวจสอบได้โดยใช้เทคนิคทางด้านอณูชีววิทยา อึ่งน้ำเต้า (Microhyla fissipes) อึ่งข้างดำ (M. heymonsi) และอึ่งลายเลอะ (M. butleri) จัดเป็นสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกที่อยู่ในสกุลเดียวกัน มีขนาดลำตัวใกล้เคียงกันและมีการกระจายอยู่ในทุกภาคของประเทศไทย จากการสำรวจเบื้องต้นพบว่าอึ่ง 2 หรือ 3 ชนิด มีการใช้พื้นที่อยู่อาศัยร่วมกัน และที่สำคัญด้วยธรรมชาติของอึ่งที่มีการปฏิสนธิภายนอกร่างกายเป็นการเพิ่มความเสี่ยงในการเกิดการผสมข้ามสายพันธุ์ได้ การศึกษาครั้งนี้จึงสนใจตรวจสอบความหลากหลายทางพันธุกรรมของยีน COI และประเมินความเป็นไปได้ในการเกิดการผสมข้ามสายพันธุ์ระหว่างอึ่งทั้งสามชนิดในธรรมชาติ โดยนำอึ่งน้ำเต้าจำนวน 48 ตัว อึ่งข้างดำจำนวน 43 ตัวและอึ่งลายเลอะจำนวน 9 ตัว ที่เก็บมาจากสวนสัตว์เปิดเขาเขียว จังหวัดชลบุรี มาตรวจหาและเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในไมโทคอนเดรียลดีเอ็นเอที่สกัดมาจากเนื้อเยื่อตับของอึ่งทั้งสามชนิด และเพิ่มปริมาณยีน COI โดยใช้เทคนิคพีซีอาร์ ผลการศึกษาพบว่าผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของอึ่งทั้งสามชนิดจำนวน 72 ตัวอย่างให้ผล sequencing ชัดเจนและน่าเชื่อถือ โดยลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้มีความยาว 677 คู่เบส จากการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยโปรแกรม DnaSP พบจำนวนแฮพโพลไทป์ที่แตกต่างกันจำนวน 36 แฮพโพลไทป์ ที่มีความแปรผันทางพันธุกรรมจำนวน 189 (27.92%) ตำแหน่ง มีค่าความหลากหลายของแฮพโพลไทป์ และค่าความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์ค่อนข้างสูง โดยเฉลี่ยเท่ากับ 0.973 ± 0.006 และ 0.10891 ± 0.00525 ตามลำดับ ระยะห่างทางพันธุกรรมระหว่างประชากรของอึ่งทั้งสามชนิดอยู่ระหว่าง 0.000 ถึง 0.223 แสดงว่าประชากรของอึ่งทั้งสามชนิดมีความแตกต่างทางพันธุกรรมของยีน COI ค่อนข้างสูง ซึ่งเหมาะที่จะนำมาใช้เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอเพื่อใช้ในการจำแนกชนิดของอึ่งทั้งสามชนิด นอกจากนี้จากการศึกษาความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการยังพบว่าอึ่งน้ำเต้า อึ่งข้างดำ และอึ่งลายเลอะมีความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการเป็นแบบ monophyletic group การตรวจพบการเกิด gene flow ระหว่างประชากรของอึ่งข้างดำและอึ่งน้ำเต้า และระหว่างประชากรของอึ่งลายเลอะและอึ่งน้ำเต้า แสดงว่าอึ่งทั้งสองชนิดนั้นสามารถผสมข้ามสายพันธุ์กันได้ในธรรมชาติ

คำสำคัญ: การผสมข้ามสายพันธุ์, สัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก, ไมโทคอนเดรียลดีเอ็นเอ, ยีนโฟลว์

Abstract

Hybridization is a mating between genetically different species. It results from incomplete reproductive isolation. Viable and fertile hybrids may lead to gene flow between populations or species. This can be checked using molecular biology techniques. Ornate Chorus Frog (Microhyla fissipes), Dark-sided Chorus Frog (M. heymonsi) and Noisy Chorus Frog (M. butleri) are amphibians of the same genus. They are similar in body size, found all over Thailand and share their habitats. Essentially, the external fertilization of amphibians may increase the risk of hybridization. Therefore, this study aims to investigate genetic diversity among these three Microhyla species in order to design species-specific mtDNA marker to identify species, and to detect possible natural hybridization. Forty-eight M. fissipes, Forty-three M. heymonsi and nine M. butleri individuals were collected from Khao Khew Open Zoo, Chonburi province. All of the collected samples were screened and compared in terms of the COI gene base sequences of the mitochondrial DNA extracted from the liver tissue. The results showed that only seventy-two samples had obvious and reliable COI sequences, 677 base pairs. Thirty-six unique haplotypes based on 189 (27.92%) variable sites were detected from the 72 aligned sequences using DnaSP program. The haplotype diversity (hd) and nucleotide diversity (π) were high. On average, hd = 0.973 ± 0.006 and π = 0.10891 ± 0.00525. In addition, the genetic distance between populations ranged from 0.000 to 0.223, indicating high genetic diversity among the three Microhyla species. These results revealed that the COI gene is suitable for use as a species-specific mtDNA marker. Moreover, phylogenetic analysis of the mtDNA haplotypes indicated that M. fissipes, M. heymonsi and M. butleri are monophyletic in their evolutionary relationships. Furthermore, the detections of gene flow between the two species may indicate the occurrence of historical natural hybridization between M. heymonsi and M. fissipes, and between M. butleri and M. fissipes.

Key words: hybridization, amphibian, gene flow, mitochondrial DNA

วัตถุประสงค์

เพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของยีน COI และยีน 16S rRNA ในไมโทคอนเดรียลดีเอ็นเอของอึ่งน้ำเต้า (Microhyla fissipes) อึ่งข้างดำ (M. heymonsi) และอึ่งลายเลอะ (M. butleri) ในพื้นที่สวนสัตว์เปิดเขาเขียว จังหวัดชลบุรี
เพื่อออกแบบเครื่องหมายดีเอ็นเอที่เหมาะสมและมีความจำเพาะต่อชนิดของอึ่งทั้งสามชนิดจาก ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI หรือยีน 16sRNA ที่ได้

รูปที่ 1 แสดงลักษณะสัณฐานภายนอกของอึ่งน้ำเต้า